넉아웃 마우스(knockout mouse)는 유전자 조작에 의해 생성된 쥐로, 일부 유전자를 다른 것으로 교체하거나 인공 DNA 조각을 넣는 방법을 통해 그 유전자의 발현을 억제(inactivate;”knocked out”)한 쥐를 말합니다. 그렇게 억제된 DNA는 행동, 외모같은 쥐의 표현형(phenotype)을 변화시키는데, 이것으로 그 유전자가 어떤 기능을 하는지 유추할 수 있습니다.

사람은 쥐와 많은 유전자를 공유하고 있기 때문에 넉아웃 마우스를 이용한 정보를 가지고 사람에 나타나는 질병에 대해 많은 정보를 얻을 수 있습니다. 넉아웃 마우스를 이용해 사람에게 나타나는 질병을 모델링 한 연구로는 암, 비만, 심장병, 당뇨, 관절염, 약물남용, 불안, 노화, 파킨슨병 등이 있습니다. 게다가 넉아웃 마우스는 또한 약이나 치료법의 효능을 시험하는 데에도 쓰이곤 합니다. 매 년 수백만 마리의 넉아웃 마우스가 실험에 사용된다고 합니다.

수십년간 과학자들은 어떤 유전자의 기능을 알아보기 위해서 그 유전자를 정확하게 통제하는 방법을 찾기 위해서 노력했습니다. 그러던 중에 1980년대 초에 유전자 형질 전환(gene transfer; transgenics) 기술이 개발되었습니다. 새로 등장한 이 기술은 수정란의 핵에 유전 물질을 주입하는 전핵미세주입(pronuclear microinjection ;PMI) 기술로 발전했습니다.
전핵이란, 정자와 난자가 만나서 생긴 수정란이 분열하기 전에, 난자의 핵과 정자의 핵이 만나기 전 상태를 말합니다. 그런 전핵에 외부 유전자를 주입해서 배아 염색체에 통합시키는 것입니다. 주사를 통해 DNA가 세포의 게놈에 합류하게 되고, 변형된 수정란을 또다시 임신한 암컷에 주입해서 형질 변환 동물을 얻는 것입니다.

이 기술의 가장 큰 단점은 주입한 외부 유전 물질이 원래 유전자의 어느 위치에 결합할지 정할 수 없고, 예상조차 할 수 없다는 점입니다. 유전자의 위치는 형질의 발현에 중요한 요소이기 때문에 같은 처리를 한 쥐들이라도 여러가지 표현형을 가질 수 있는 것이지요.

형질변환쥐

그런 전핵미세주입의 문제점은 유전자 녹아웃(genetic knockout)이란 해법이 제시되면서 해결되었습니다. 즉, 녹아웃 기술을 통해 과학자들은 쥐의 게놈에서 어느 위치에 유전자를 주입할지 정할 수 있게 되었습니다. 이 기술을 이용하면 관심있는 쥐의 특정 유전자를, 비활성/변형시킨 대립 유전자(allele)를 이용해서, 침묵시키거나 대체할 수 있습니다.  즉, 유전자 녹아웃은 배아줄기세포(embryonic stem cell)에서 특정 타겟 유전자를 선택적으로 침묵시키는 것입니다. 따라서 녹아웃 기술을 이용하면 특정 유전자를 제거하는 것으로 그 유전자가 생물 내에서 어떤 영향을 미치는지를 알 수 있습니다. 그렇기 때문에 녹아웃 마우스는 유전자를 연구하는 데에 매우 유용한 방법이 되었습니다.

유전자를 표적화(gene targeting)하는 데에는 두 가지 과정이 수반됩니다. 먼저, 운반체(vector)를 만드는 과정입니다. 운반체가 만들어지면, 운반체를 배아 줄기세포에 넣고 이 세포에서 새로운 쥐가 만들어집니다. 운반체는 양 끝에 접합 부위(regions of homology)와, 변형시킨 관심있는 유전자, 그리고 전체 과정이 제대로 진행되었는지 확인하기 위한 2가지의 추가 유전자를 포함하고 있습니다.

운반체 양 끝의 접합 부위(regions of homology)는 관심있는 유전자를 둘러싼 게놈과 상보적으로 결합할 수 있어서 운반체를 게놈의 특정 위치에 결합할 수 있게 합니다. 운반체는 이 두 곳의 접합 부위를 통해 게놈의 원하는 위치에 결합하게 되는 것입니다.

2가지의 추가 유전자는 운반체가 제대로 삽입되었는지 확인하기 위해 사용됩니다. 2가지 유전자 중 하나인 네오마이신(neomycin) 저항 유전자로는 운반체가 삽입되지 않은 세포들을 걸러낼 수 있습니다. 네오마이신 저항 유전자가 없으면, 네오마이신을 처리한 환경에서 세포가 살 수 없기 때문입니다. 하지만, 만약 운반체가 원하지 않은 장소에 삽입된 경우에, 네오마이신 저항 유전자로 구별할 수 없습니다.
이럴 때를 대비해서, 티미딘키나아제(thymidine kinase;tk) 유전자를 사용합니다. 티미딘키나아제 유전자(tk)는 접합 부위보다 바깥쪽에 붙여놓습니다. 유전자 재조합이 제대로 일어나서 유전자 안에 tk가 없으면, 세포는 간시클로비르(gancyclovir)에 영향을 받지 않습니다. 하지만 다른 곳에 삽입된 tk유전자가 있으면, 간시클로비르 안에서 세포는 죽게 됩니다. 이런식으로 제대로 재조합된 세포를 걸러내는 것입니다.

운반체 삽입

배아줄기세포는 여러 세포로 분화할 수 있기 때문에(pluripotent) 만들어진 운반체(vector)를 배아줄기세포에 주입합니다. 특정 유전자의 작용을 알고 싶을 때 배아줄기세포에서 그 유전자를 녹아웃 시키고, 이 배아줄기세포를 최근에 수정된 배아(embryo)에 넣습니다. 조작된 세포는 그 안에서 분열하게 되고, 많은 조직을 형성하게 됩니다. 그 결과 몸의 일부 조직, 세포가 녹아웃된 배아 줄기 세포에서 분열한 세포로 이루어진 쥐가 되는 것입니다.

예를 들어, 갈색 털의 쥐로 자라날 배아줄기세포를 흰색 털의 쥐의 배반포(blastocyst)에 주입합니다. 이는 쥐에서 배아줄기세포의 세포가 발견되는지를 알아보는데 쓰입니다. 흰 털의 쥐가 나오면, 주입한 배아줄기세포가 배반포에 접합(graft)되지 않았다는 뜻입니다. 반면에, 갈색과 흰 털을 모두 가진 쥐가 나오면, 이는 녹아웃 시킨 배아줄기세포가 제대로 접합되었다는 의미로 해석할 수 있습니다.

이렇게 배아줄기세포가 접합된 쥐들 중 생식선 전이(germ-line transmission)가 일어나 그 유전자가 자손에 전해지도록 키웁니다. 몇몇 세포가 녹아웃 되어있더라도 다른 세포들이 그렇지 않으면 그 유전자의 영향을 알기 어렵기 때문입니다. 생식선 전이가 일어나서 녹아웃된 유전자만 가진 쥐들이 태어나면, 그렇지 않은 쥐들과 비교하여 그 유전자의 작용을 알 수 있는 것입니다.

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